液体クロマトグラフィー質量分析および液体クロマトグラフィーイオンモビリティースペクトロメトリ ー｜質量分析による脂質の異性体の探索

液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)および液体クロマトグラフィー-イオン移動度分光分析-質量分析(LC-IMS/MS)技術を使用して、照射眼における脂質の異性体を探索しました。

背景

脂質は生体膜の主要な構造成分であり、その組成の変化はがんをはじめとする様々な疾患と関連しています。二重結合の存在により多数の異性体状態で存在することができ、脂質はその構造上、様々な官能基を有しています。

生体内では、脂質の機能は、その特定の異性体に依存しています。例えば、多価不飽和脂肪酸を含む脂質のシス異性体は、膜の恒常性維持に極めて重要な役割を担います。したがって、正常な状態および病気の状態における脂質の機能を知るために、脂質の異性体を特定することは非常に重要です。

光受容体における視覚伝達の第一段階として、光照射により11-cis異性体がtrans-retinal(プレノール脂質)に変換される眼内脂質の光異性化がよく知られています。

さらに、太陽光の照射によって異性化する眼球脂質も存在するはずです。

ある化合物の異性体は、分子式が同じであり、マススペクトルでも同じm/zで検出されます。したがって、典型的なマススペクトルだけでは区別がつきません。LC/MSとLC-IMS/MSの技術により、それぞれリテンションタイム(RT)とドリフトタイムに基づいて異性体を分離することができます。

ソリューション

6個の眼球から脂質を抽出し、各抽出液を2本のガラス瓶に均等に分け、6個のペアサンプルを得ました。

各ペアのサンプルのうち1つに太陽光を直接照射し、LC/MS ( Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM, Thermo Scientific)で分析しました。

その結果、驚くべきことに、太陽光を照射した眼球抽出液では900種以上の脂質が減少しており、照射によりこれらの分子が異性化または分解したことが示されました(図1)。

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本研究では、照射した眼球抽出液で最も顕著な減少を示したm/z 880.72に着目しました(図1)。

MS/MSのフラグメンテーションから、このイオンはプレノール脂質に属するコエンザイムQ10(CoQ10)のアンモニウム付加物であることが判明しました(図2)。

次に、CoQ10が異性化しているかどうかを確認するため、m/z 880.72のイオンの抽出イオンクロマトグラム(EIC)を調査しました。興味深いことに、照射した眼球抽出液のデータでは、2つの異なる保持時間(RT)にCoQ10のピークが観察されたのに対し、非照射抽出液のデータでは1つのピークが観察されました(図3)。

また、2つのRTで取得したMS/MSスペクトルも同様のパターンを示し、いくつかの特徴的なフラグメントが確認されました(図4)。

これらの結果から、眼球エキス中のCoQ10は太陽光照射により異性化することが明らかとなりました。

次に、太陽光を照射した新鮮な眼球を用いてLC/MSを行ったところ、同様の結果が得られました。

また、太陽光を照射した標準品CoQ10では、一貫して異性化が観察されました(図5)。

さらに、LC-IMS/MS(SYNAPTTM G2 HighDefinition Mass SpectrometryTM system,Waters, Milford, MA, USA)によりCoQ10の異性体を分離しました(図6)。異性体ピークの間には、0.05 msのドリフト時間の差が観察されました。

サマリー

• LC/MSでは、個々のCoQ10異性体について明確なピークが確認されました。したがって、この技術は、生体試料を含む幅広い試料中の異性体を探索することが可能である。
• LC-IMS/MSでは、ドリフト時間からCoQ10の異性体が分離され、異性化がさらに確認された。

参考文献

1. Mamun, M. Al et al. Coenzyme Q10 in theeye isomerizes by sunlight irradiation. Sci.Reports 2022 121 12, 1–14 (2022).